Картирование геномов. Стратегия генетического картирования и его роль в идентификации новых генов наследственных заболеваний Картирование генома человека

Важнейшей задачей молекулярной генетики применительно к медицине является идентификация генов наследственных заболеваний человека и выявление конкретных повреждений в них, приводящих к развитию фенотипических проявлений болезни. Эта задача может пить выполнена с помощью нескольких основных под-
\ОДОВ.
Первый подход к идентификации генов, остававшийся ведущим приблизительно до начала 90-х годов,
| чзируется на имеющейся информации об основном био- х11 мическом дефекте (первичном белковом продукте гена), ха- рактеризующем изучаемую болезнь | Шишкин С.С., Калинин В.Н., ] 992; Gardner Е. et al., 1991; Collins F., 1995].
I l"-реход от белкового анализа на уровень ДНК осуществлялся через секвенирование очищенного белкового продукта и получение ДНК-зондов, использование моноклональных антител и с помощью некоторых других методических приемов. Хромосомная локализация гена в данной схеме поиска является конечным результатом исследования. Описанный подход, использующий ту или иную предварительную информацию о функциональном значении искомого гена, получил название «функциональное клонирование» . Примером успешного применения функционального клонирования является идентификация гена фенилкетонурии. К сожалению, данный метод может быть применен лишь к весьма ограниченному кругу заболеваний человека, тогда как для большинства наследственных болезней первичные продукты гена или патогномоничные биохимические маркеры неизвестны.
Совершенствование молекулярных технологий привело к созданию принципиально иной стратегии поиска гена, не требующей каких-либо предварительных знаний о его функции или первичном биохимическом продукте. Данная стратегия предполагает идентификацию гена на основании точного знания его локализации в определенном хромосомном локусе - «позиционное клонирование» (менее удачный термин «обратная генетика») . Позиционное клонирование ведет к установлению молекулярной основы болезни «от гена к белку» и включает следующие основные этапы: 1) картирование гена болезни в определенном участке конкретной хромосомы (генетическое картирование); 2) составление физической карты изучаемой хромосомной области (физическое картирование); 3) идентификация экспрессирующихся последовательностей ДНК в изучаемой области; 4) секвенирование генов-кандидатов и выявление мутаций в искомом гене у больных лиц; 5) анализ структуры гена.
расшифровка последовательности и первичной структуры его продуктов - мРНК и белка . В ряде случаев позиционное клонирование гена облегчается при обнаружении у больных видимых ци го- генетических перестроек или определяемых делеций в критической хромосомной области, позволяющих значительно повысить точность картирования мутантного гена. Выявление таких перестроек способствовало, в частности, успеху в клонировании генов миодистрофии Дюшепна/Бекера, нейрофиброматоза 1-го типа, туберозного склероза, адренолейкодистрофии и других наследственных заболеваний нервной системы.
Одним из важных промежуточных результатов исследовательского прост а «Геном человека» стало со- здапие все более и более насыщенной транскрипционной карты генома, содержащей сведения о тысячах уже известных генов и экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей. Это способствовало значительному развитию еще одного подхода к идентификации первичного генетического дефекта, при котором после предварительного картирования мутантного гена проводится скрининг подходящих генов-кандидатов, расположенных в том же хромосомном участке (lt;lt;positional candidate approach») . Данный метод предполагает наличие определенных знаний о патофизиологии изучаемого заболевания, что дает возможность проводить рациональный отбор гепов-кандидатов для анализа из большого числа генов, которые могут быть расположены в «зоне интереса». Среди неврологических наследственных заболеваний, гены которых были идентифицированы таким образом благодаря анализу подходящих кандидатов в установленном хромосомном интервале, можно назвать дофа-зависимую дистонию и фридрейхо- подобную атаксию с дефицитом витамина Е. По существующим прогнозам, именно анализ «позиционных кандидатов» станет в ближайшем будущем ведущим методом идентификации генов наследственных болезней, чему в немалой степени способствует создание и постоянное расширение компьютерных баз данных экспрессирующихся последовательностей на хромосомах («expressed sequence tags») .
Таким образом, определение хромосомной локализации искомого гена - генетическое картирование - является первым, ключевым шагом на пути к раскрытию молекулярной основы того или иного наследственного заболевания.
Существует несколько основных методов, позволяющих картировать неизвестный ген в конкретном хромосомном локусе: а) клинико-генеалогический (простейший и наиболее давний) - основан на анализе наследования признаков в больших родословных; примером может служить установление локализации гена на Х-хро- мосоме в случае передачи болезни по Х-сцепленному типу; б) цитогенетический - базируется на ассоциации выявляемых при микроскопии хромосомных перестроек с определенным клиническим фенотипом; в) метод гибридизации in situ (в том числе его современная модификация - флюоресцентная гибридизация in situ, FISH) - использует специфическую гибридизацию мРНК и кДНК искомого гена с денатурированными хромосомами на метафазных препаратах клетки; г) метод гибрид ных клеток - основан на анализе совместной сегрегации клеточных признаков и хромосом в клонированных in vitro гибридных соматических клетках [Фогель Ф., Мотульски А., 1990; Gardner Е. et al., 1991]. Все эти методы нашли свое применение в современной молекулярной генетике, однако они обладают серьезными ограничениями, связан ными как с недостаточной разрешающей способностью, так и с существованием жестких предусловий, необходимых для проведения исследования (таких как наличие зондов, доступность селективных систем для отбора гибридных клеток и т.п.). Наиболее мощным, продуктивным и широко используемым в настоящее время методом картирования генов наследственных болезней человека является так называемый linkage-анализ - анализ сцепления искомого гена с набором точно локализованных генетических маркеров .
Центральное положение linkage-анализа заключается в том, что мерой относительного генетического расстояния между двумя локусами па хромосоме может служить частота рекомбинаций между этими локусами в результате кроссинговера гомологичных хромосом в мейозе. Чем ближе расположены локусы па хромосоме, I ем больше вероятность того, что они будут наследоваться как единое целое (группа сцепления); при значительной удаленности изучаемых локусов (т.е. слабой степени сцепления) они с большей вероятностью разойдутся после кроссинговера по разным хромосомам. Частота рекомбинации между локусами 1% принята за единицу

1. енетического расстояния между ними - 1 сантиморга- ниду (сМ), что эквивалентно в среднем 1 миллиону п.о. Следует подчеркнуть, что частота рекомбинаций и, следовательно, генетическое расстояние, неодинаковы для мужчин и женщин (больше у женщин), для разных хромосом, а также для разных участков одной хромосомы («горячие точки» рекомбинации) .

Сущность анализа сцепления состой! в сопоставлении наследования патологического признака (болез-

Рис. 30. Принцип анализа генетического сцепления на примере аутосомно-доминантного заболевания В данном примере исследованы 4 сцепленных маркера А, В, С и D, по которым реконструированы гаплотипы. Разные по происхождению хромосомы маркированы различными типами штриховки (исходная мутантная хромосома обозначена черным цветом). Все больные в родословной имеют одну и ту же общую (среднюю) часть исходной мутантной хромосомы. Например, в нижнем поколении хромосомы претерпели ряд рекомбинаций, однако у всех больных сибсов (в том числе у лиц Ш-З и Ш-8) сохраняется один и тот же мутантный гаплотип по маркерам В и С (гаплотип у). Напротив, никто из здоровых сибсов в нижнем поколении не унаследовал от отца гаплотип j по маркерам В и С (индивидуум Ш-4 унаследовал хромосому, в которой рекомбинация произошла ниже критического сегмента). Таким образом, сегрегация маркерных аллелей и анализ гаплотипов свидетельствуют о том, что ген заболевания расположен в хромосомном сегменте, включающем в себя маркеры В и С. Соответственно, внешними границами участка хромосомы, в пределах которого расположен мутантный ген, являются маркеры А и D.
и тот же аллель исследуемого маркера, это свидетельствует об отсутствии рекомбинаций между искомым мутантным геном и данным маркером, т.е. о наличии сцепления между ними. Пример сцепления между геном аутосомно-доминантного заболевания и определенными генетическими маркерами представлен на рис. 30.
Для достоверного доказательства сцепления разработан специальный математический аппарат . Принцип расчета заключается в сопоставлении вероятностей гипотез о наличии и отсутствии сцепления при имеющихся семейных данных и выбранной частоте рекомбинаций 0; соотношение этих двух вероятностей (соотношение правдоподобий) выражает шансы за и против сцепления. Для удобства используется десятичный логарифм соотношения правдоподобий - Лод- балл (от англ. Logarithm of the Odds, или LOD):
Po
LOD = Logio --
P1/2 , где P - вероятность
полученного распределения семейных данных для сцепленных генов с частотой рекомбинаций 0, Р - вероятность такого распределения для двух несцепленных свободно рекомбинирующих генов (частота рекомбинаций 0 = 1/2). Использование логарифмической формы расчета позволяет проводить сложение 27од-баллов, полученных при анализе отдельных родословных. Для доказательства генетического сцепления принято значение Лод- балла +3, которое означает соотношение шансов 1000:1 в пользу наличия генетического сцепления междgt; маркером и изучаемым признаком. Лод-балл -2 и ниже свидетельствует о достоверном отсутствии сцепления; значения Лод-балла от +3 до - 2 являются, соответственно, более или менее предположительными с точки зрения наличия сцепления и нуждаются в дальнейшем подтверждении. Частота рекомбинаций 0, для которой был выявлен максимальный Л од-балл, является отражением наиболее вероятного генетического расстояния между изучаемыми локусами; ориентировочно считается, что 1% рекомбинаций свидетельствует об очень тесном сцеплении, частота рекомбинаций около 5% - о хорошем сцеплении и частота 10-20% - о некотором умеренном сцеплении.
Расчет Лоб-баллов предполагает использование специального компьютерного программного обеспечения (программа LIPED, пакет программ LINKAGE и др.) .
Для успеха linkage-анализа необходимо, чтобы исследуемые семьи были информативны по болезни и по генетическому маркеру. Первое означает наличие достаточного числа информативных мейозов в родословной, позволяющих анализировать расхождение признаков в данной родословной. С практической точки зрения это означает наличие большого числа доступных для анализа больных и здоровых родственников, как правило, из нескольких поколений. Информативность по маркеру предполагает его полиморфизм (т.е. существование большого числа аллелей) и гетерозиготность у ключевых членов семьи, что позволяет дифференцировать генетическое происхождение конкретных аллелей маркера. До конца 80-х годов основным типом маркеров, используемых в анализе сцепления, были участки ДНК хромосом, имеющие в своем составе вариацию в одной паре оснований и различаемые по наличию или отсутствию участка рестрикции для соответствующего фермента, т.е. по длине рестрикционных фрагментов («restriction fragment length polymorphism», RFLP) . Новая эра в генетическом картировании наступила с открытием класса высокополиморфных маркеров, представляющих собой участки ДНК, состоящие из вариабельного числа копий тандемных (СА)п-повторов и обладающие чрезвычайно высокой гетерозиготностью . Это позволило в значительной степени разрешить проблему информативности используемых маркеров и способствовало существенному прогрессу linkage-анализа. По некоторым оценкам, для скрининга полного гаплоидного генома и выявления генетического сцепления необходимо иметь 200-300 высокополиморфных маркеров, равномерно распределенных по хромосомам . Генетические карты последнего поколения включают свыше 5000 таких маркеров , что позволяет считать сегодня задачу установления генетического сцепления принципиально возможной в любых информативных родословных .
Серьезных проблемой, с которой приходится сталкиваться при проведении анализа сцепления на серии семей, является проблема возможной генетической гетерогенности изучаемого клинического синдрома. В случае, если изучаемый фенотип может вызываться мутациями в разных генах, механическое сложение полученных в отдельных семьях положительных (при наличии сцепления) и отрицательных (при его отсутствии) Лод- баллов ведет к нивелированию суммарного значения Лод- балла и ложному выводу о полном отсутствии сцепления. Примером может служить аутосомно-доминантная моторно-сенсорная невропатия 1 типа, обусловленная мутациями в разных генах, локализованных на 1-й, 17-й и других хромосомах . В этой ситуации особое значение приобретает тщательное, детальное обследование больных и семей, направляемых для linkage-анализа, с целью отбора максимально однородных клинических групп. Дополнитеёгьным способом избежать ложно-отрицательного результата исследования является использование в процессе расче

та,/7од-баллов специальной программы HOMOG или аналогичных ей программ, позволяющих оценивать вероятность генетической гетерогенности при полученном конкретном наборе семейных данных . Наиболее действенным подходом на первом этапе исследования является анализ сцепления в одной большой информативной родословной, что позволяет заведомо иск почить возможность генетической гетерогенности в изучаемой группе больных. Дополнительные сложности при проведении linkage-анализа связаны с нередко наблюдающейся неполной пенетрант- ностью и вариабельной экспрессивностью мутантного гена, наличием фенокопий среди обследуемых членов семьи, оценкой возраста начала болезни и возможности доклинического носительства мутации, оценкой распространенности конкретных аллелей изучаемых маркеров в популяции и т.д. . Неверный учет или недооценка этих факторов могут существенно повлиять на итоговый результат, поэтому качество подробного клинико-генеалогического анализа в изучаемых семьях выступает на первый план.
Разработано много новых методов, представляющих из себя дальнейшее развитие традиционной стратегии исследования генетического сцепления и существенно повышающих скорость выполнения, методические возможности и разрешающую способность данного анализа в локализации неизвестных генов наследственных заболеваний человека. Одним из таких методов является мультилокусный анализ (multipoint linkage analysis), позволяющий оценивать Лод-баллы для совокупности сцепленных локусов в соответствии с генетической картой изучаемого хромосомного участка и определять наиболее вероятную локализацию мутантного гена в пределах данного участка . В инбредных

родословных с аутосомно-рецессивным заболеванием при наличии предположения об «эффекте основателя» исключительно продуктивным зарекомендовал себя метод гомозиготного картирования: он заключается в анализе «го- мозиготности по происхождению» {«homozygosUy-by- descent») и позволяет оценить степень гомозиготлости больных лиц по серии маркеров как результат наследования от единого предка общего хромосомного участка, включающего мутантный ген . Многообещающим является метод «экономного сканирования генома», предполагающий преимущественное использование маркеров, локализованных в «стратегических» CG насыщенных хромосомных областях, богатых экспрессирующимися последовательностями . Предложен также целый ряд других модификаций классического linkage-анализа .
Важно подчеркнуть, что анализ сцепления сохранит свое значение и после идентификации всего генома человека . Например, при изучении все еще достаточно большой группы наследственных заболеваний с неустановленными генами первым шагом на пути к выяснению молекулярного дефекта может служить /ш/ш^е-апализ и определение хромосомного локуса болезни, с последующим скринингом подходящих генов в данной области. Чрезвычайно важной в успехе генетического картирования является роль клинициста. Она заключается в адекватном отборе репрезентативных семей, детальной оценке клинического статуса всех включенных в исследование членов семьи, точной диагностике болезни и оценке характера сегрегации мутантного гена, а также в решении многих других ключевых вопросов.

Генетические карты сцепления. Генетические карты сцепления определяют хромосомную принадлежность и взаимное расположение генетических маркеров относительно друг друга. Картирование в узком смысле -- определение положения гена или мутации в хромосоме. Позднее этот термин получил более широкое толкование. Он относится не только к гену, но к любому маркеру, под которым подразумевают ген, мутацию, участок ДНК с неопределенной функцией, точку расщепления ДНК рестриктазами. Таким образом, маркер -- это любой наследуемый признак, доступный идентификации тем или иным способом. Установление локализации какого-либо маркера позволяет использовать его для определения положения другого маркера.

На практике именно генетические карты сцепления и только они позволяют локализовать сложные генетические маркеры (например, ассоциированные с симптомами заболевания) на первых этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения.

До начала 70-х годов XX в. построение генетических карт человека продвигалось очень медленными темпами. Первый ген человека (ген цветной слепоты) был картирован на Х-хромосоме в 1911 г., а первый аутосомный ген -- только в 1968 г. К 1973 г. на хромосомах человека было картировано 64 гена, а к 1994 г. -- 5000 структурных генов и свыше 60 000 маркерных ДНК-последовательностей. Столь стремительный прогресс в картировании генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенети-ке, в клеточных культурах и особенно в молекулярной генетике.

Гибридизация соматических клеток. Одним из наиболее популярных методов отнесения генетического маркера (функционально активного гена) к конкретной группе сцепления является гибридизация (слияние друг с другом) соматических клеток разных биологических видов организмов, один из которых -- исследуемый. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом человека. Потеря хромосом носит случайный характер, и образующиеся клоны клеток содержат оставшиеся хромосомы в разных сочетаниях. Так получают панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов.

Гибридизация in situ (в том же месте). Этот метод дает возможность локализовать определенные последовательности нуклеотидов на хромосомах. Они выступают в качестве зондов. Препараты фиксированных хромосом гибридизуют с исследуемыми последовательностями, меченными радиоактивной или флуоресцентной меткой. Меченые молекулы оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные меченому зонду. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после радиоавтографии. Этот метод по частоте использования в последнее время прочно выходит на первое место. Наиболее популярной оказалась группа методов, получивших название флуоресцентной гибридизации in situ -- метод FISH (от англ. Fluorescence in situ hybridization ).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволила быстро и эффективно амплифицировать почти любой участок генома человека, а полученные продукты ПЦР использовать в качестве зондов для картирования соответствующих участков на хромосомах путем гибридизации in situ . В этом плане успешно разработана концепция сайтов, привязанных к последовательностям, --STS (от англ. Sequence-tagged sites). Все фрагменты ДНК, которые используются для построения генетических и физических карт, можно однозначно идентифицировать с помощью последовательности нуклеотидов длиной в 200 -- 500 н.п., которая является уникальной для данного фрагмента. Эти сайты амплифицируют с помощью ПЦР и применяют в качестве зондов. STS позволили создать основу для разработки единого языка, дающего возможность разным лабораториям описать свои клоны. Конечным результатом разработки концепции STS является создание исчерпывающей карты STS генома человека. Для получения маркеров в настоящее время часто применяют праймеры, соответствующие диспергированным повторяющимся последовательностям, среди которых первыми стали использовать А1u-последовательности, так как они характерны именно для генома человека. Поскольку в геноме человека больше 90 % умеренно повторяющихся последовательностей представлены семействами А1u и Крn I (последние повторяются реже и обладают характерной локализацией в хромосомах), они и используются для получения соответствующих зондов в ПЦР-реакции.

Физические карты низкого разрешения. Физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах нуклеотидов. Физическую карту низкого разрешения часто называют хромосомной (цитогенетической) картой генома.

В начале 70-х годов XX в. появилась реальная возможность точной идентификации не только всех хромосом в кариотипе человека, но и их отдельных сегментов. Это связано с появлением мето да дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом. Хромосомные препараты окрашивают некоторыми флуорохромами после соответствующей протеолитической обработки или нагревания. При этом на хромосомах выявляется характерная поперечная исчерченность -- так называемые диски (бэнды), расположение которых специфично для каждой хромосомы. Величина небольших дисков на прометафазных хромосомах соответствует примерно 1 млн н.п. на физических картах. Каждая хромосома после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо р) либо вниз (длинное плечо -- q) . Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Запись положения гена на карте включает номер хромосомы, плечо, номер сегмента, бэнда и его субъединицы.

Запись 7 q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7. Подобная запись удобна для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ, позволяющего локализовать ген с точностью до одного бэнда и даже его субъединицы.

Хромосомные карты генома человека получают также локализацией генетических маркеров, чаще всего методом FISН: для метафазных хромосом разрешающая способность хромосомных карт находится в пределах 2 -- 5 млн н.п.; для интерфазных хромосом (генетический материал находится в менее компактной форме) -- приближается к 100 тыс. н.п. Для этого уровня картирования характерны карты кДНК (с. 358). Они отражают положение экспрес-сирующихся участков ДНК (экзонов) относительно известных ци-тогенетических маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты дают представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использованы для поиска новых генов. Этот подход полезен при поиске генов, повреждение которых вызывает заболевания человека, в том случае, если приблизительная локализация таких участков хромосом уже проведена на генетических картах сцепления (см. рис. 100).

Физические карты высокого разрешения. Для построения физических карт высокого разрешения экспериментально реализуется два альтернативных подхода: картирование сверху вниз и картирование снизу вверх (рис.В к геному) . Для картирования сверху вниз препарат ДНК индивидуальной хромосомы человека разрезают крупнощепящими рестриктазами (например, Not I) на длинные фрагменты, которые после разделения методом электрофореза в пульсирующем поле подвергаются дальнейшей обработке другими рестриктазами.

Методом электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или полиакриламидном гелях удается разделить фрагменты ДНК размером не более 30 --50 тыс. н.п. Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. В этом случае удается разделить молекулы ДНК размером от 50 тыс. н.п. до 10 млн н.п.).

В результате получают макрорестрикционную карту. Метод электрофореза был с успехом использован для картирования малых геномов.

Для картирования генома человека снизу вверх на основе препарата суммарной ДНК генома или индивидуальной хромосомы получают серию случайных клонов протяженных последовательностей ДНК (10-- 1000 тыс. н.п.), часть из которых перекрывается друг с другом. В качестве вектора для клонирования в этом случае используют искусственные минихромосомы дрожжей (УАС). Последовательный набор клонов, содержащих частично перекрывающиеся и дополняющие друг друга фрагменты ДНК из определенного района генома, получил название скользящего зондирования, или «прогулки по хромосоме». Каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих исследуемый участок генома, получивший название «контиг». Эта стратегия впервые была успешно применена для изучения 3-й хромосомы дрозофилы. С ее помощью редко удается пройти более 200 -- 300 тыс. н.п. в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК. Для преодоления таких ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей Ф. Коллинз, ныне президент Международного консорциума, предложил метод «прыжков» по хромосоме, позволяющий изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч пар нуклеотидов (длина прыжка), не выделяя при этом все промежуточные последовательности ДНК.

Правильность полученных контигов подтверждают обычно гибридизацией in situ (FISH) с одновременной привязкой к определенным участкам исследуемых хромосом.

Вскоре после переоткрытия законов Менделя немецкий цитолог Теодор Бовери (1902) представил доказательства в пользу участия хромосом в процессах наследственной передачи, показав, что нормальное развитие морского ежа возможно только при наличии всех хромосом. В это же время (1903 г.) американский цитолог Уильям Сэттон обратил внимание на параллелизм в поведении хромосом в мейозе и гипотетических факторов наследственности, существование которых предсказал еще сам Мендель.

Уильям Сэттон предположил, что в одной хромосоме может находиться несколько генов. В этом случае должно наблюдаться сцепленное наследование признаков, т.е. несколько разных признаков могут наследоваться так, как будто они контролируются одним геном. В 1906 г. У. Бэтсон и Р. Пеннет обнаружили сцепленное наследование у душистого горошка. Они изучали совместное наследование: окраски цветков (пурпурная или красная) и формы пыльцевых зерен (удлиненная или округлая). При скрещивании дигетерозигот в их потомстве наблюдалось расщепление 11,1:0,9:0,9:3,1 вместо ожидаемого 9:3:3:1. Создавалось впечатление, что факторы окраски и формы пыльцы имеют тенденцию при рекомбинации задатков оставаться вместе. Это явление авторы назвали «взаимным притяжением факторов», но природу его им выяснить не удалось.

Дальнейшее изучение хромосом как носителей информации происходило в первые десятилетия ХХ века в лаборатории Томаса Ханта Моргана (США) и его сотрудников (А. Стёртеванта, К. Бриджеса, Г. Мёллера). В качестве основного объекта исследований Морган использовал плодовую мушку дрозофилу (Drosophila melanogaster), которая оказалась очень удобным модельным объектом:

– Во-первых, эта мушка легко культивируется в лабораторных условиях.

– Во-вторых, она характеризуется малым числом хромосом 2 n = 8).

– В-третьих, в слюнных железах личинок дрозофилы имеются гигантские (политенные) хромосомы, удобные для прямого наблюдения.

– И, наконец, дрозофила отличается высокой изменчивостью морфологических признаков.

На основании экспериментов с плодовой мушкой дрозофилой Морганом и его учениками была разработана хромосомная теория наследственности.

Основные положения хромосомной теории наследственности:

1. Ген – это элементарный наследственный фактор (термин «элементарный» означает «неделимый без потери качества»). Ген представляет собой участок хромосомы, отвечающий за развитие определенного признака. Иначе говоря, гены локализованы в хромосомах.

2. В одной хромосоме могут содержаться тысячи генов, расположенных линейно (подобно бусинкам на нитке). Эти гены образуют группы сцепления. Число групп сцепления равно числу хромосом в гаплоидном наборе. Совокупность аллелей в одной хромосоме называется гаплотип. Примеры гаплотипов: ABCD (только доминантные аллели), abcd (только рецессивные аллели), AbCd (различные комбинации доминантных и рецессивных аллелей).

3. Если гены сцеплены между собой, то возникает эффект и сцепленного наследования признаков, т.е. несколько признаков наследуются так, как будто они контролируются одним геном. При сцепленном наследовании в череде поколений сохраняются исходные сочетания признаков.

4. Сцепление генов не абсолютно: в большинстве случаев гомологичные хромосомы обмениваются аллелями в результате перекреста (кроссинговера) в профазе первого деления мейоза. В результате кроссинговера образуются кроссоверные хромосомы (возникают новые гаплотипы, т.е. новые сочетания аллелей.). С участием кроссоверных хромосом в последующих поколениях у кроссоверных особей должны появляться новые сочетания признаков.

5. Вероятность появления новых сочетаний признаков вследствие кроссинговера прямо пропорциональна физическому расстоянию между генами. Это позволяет определять относительное расстояние между генами и строить генетические (кроссоверные) карты разных видов организмов.

КРОССИНГОВЕР

Кроссинговер (от англ. crossing-over – перекрёст) – это процесс обмена гомологичными участками гомологичных хромосом (хроматид).

Обычно кроссинговер происходит в мейозе I.

При кроссинговере происходит обмен генетическим материалом (аллелями) между хромосомами, и тогда происходит рекомбинация – появление новых сочетаний аллелей, например, AB + ab → Ab + aB.

Механизм кроссинговера «разрыв–воссоединение»

Согласно теории Янссенса–Дарлингтона, кроссинговер происходит в профазе мейоза. Гомологичные хромосомы с хроматидами АВ и ab образуют биваленты. В одной из хроматид в первой хромосоме происходит разрыв на участке А–В, тогда в прилежащей хроматиде второй хромосомы происходит разрыв на участке a–b. Клетка стремится исправить повреждение с помощью ферментов репарации–рекомбинации и присоединить фрагменты хроматид. Однако при этом возможно присоединение крест–накрест (кроссинговер), и образуются рекомбинантные хроматиды Ab и аВ. В анафазе первого деления мейоза происходит расхождение двухроматидных хромосом, а во втором делении – расхождение хроматид (однохроматидных хромосом). Хроматиды, которые не участвовали в кроссинговере, сохраняют исходные сочетания аллелей. Такие хроматиды (однохроматидные хромосомы) называются некроссоверными; с их участием разовьются некроссоверные гаметы, зиготы и особи. Рекомбинантные хроматиды, которые образовались в ходе кроссинговера, несут новые сочетания аллелей. Такие хроматиды (однохроматидные хромосомы) называются кроссоверными, с их участием разовьются кроссоверные гаметы, зиготы и особи. Таким образом, вследствие кроссинговера происходит рекомбинация – появление новых сочетаний наследственных задатков в хромосомах.

Согласно другим теориям, кроссинговер связан с репликацией ДНК: или в пахитене мейоза, или в интерфазе. В частности, возможна смена матрицы в вилке репликации.

Генетические (кроссоверные) карты

Алфред Стёртевант (сотрудник Моргана) предположил, что частота кроссинговера на участке между генами, локализованными в одной хромосоме, может служить мерой расстояния между генами. Иными словами, частота кроссинговера, выражаемая отношением числа кроссоверных особей к общему числу особей, прямо пропорциональна расстоянию между генами. Тогда можно использовать частоту кроссинговера для того, чтобы определять взаимное расположение генов и расстояние между генами. Единицей расстояния между генами служит 1 % кроссинговера; в честь Моргана эта единица называется морганидой (М).

На основании генетического картирования составляются генетические карты – схемы, отражающие положение генов в хромосомах относительно других генов. На генетических картах крайнему гену (т.е. наиболее удаленному от центромеры) соответствует нулевая (исходная) точка. Удаленность какого-либо гена от нулевой точки обозначается в морганидах.

Построение генетических карт различных организмов имеет большое значение в здравоохранении, селекции и экологии. При изучении признаков человека (и в частности, генетических заболеваний) важно знать, какой именно ген определяет рассматриваемый признак. Эти знания позволяют составлять прогнозы при медико-генетическом консультировании, при разработке методов лечения генетических заболевания, в т.ч. и для коррекции генома. Знание генетических карт культурных растений и домашних животных позволяет планировать селекционный процесс, что способствует получению надежных результатов в краткие сроки. Построение генетических карт дикорастущих растений и диких животных важно и сточки зрения экологии. В частности, исследователь получает возможность изучать не просто фенотипические признаки организмов, а конкретные, генетически обусловленные признаки.

Двойной и множественный кроссинговер

Морган предположил, что кроссинговер между двумя генами может происходить не только в одной, но и в двух и даже большем числе точек. Четное число перекрестов между двумя генами, в конечном счете, не приводит к их перемещению из одной гомологичной хромосомы в другую, поэтому число кроссинговеров и, следовательно, расстояние между этими генами, определенное в эксперименте, снижаются. Обычно это относится к достаточно далеко расположенным друг от друга генам. Естественно, что вероятность двойного перекреста всегда меньше вероятности одинарного. В принципе она будет равна произведению вероятности двух единичных актов рекомбинации. Например, если одиночный перекрест будет происходить с частотой 0,2, то двойной – с частотой 0,2 × 0,2 = 0,04. В дальнейшем, наряду с двойным кроссинговером, было открыто и явление множественного кроссинговера: гомологичные хроматиды могут обмениваться участками в трех, четырех и более точках.

Интерференция – это подавление кроссинговера на участках, непосредственно прилегающих к точке происшедшего обмена.

Рассмотрим пример, описанный в одной из ранних работ Моргана. Он исследовал частоту кроссинговера между генами w (white – белые глаза), у (yellow – желтое тело) и m (miniature – маленькие крылья), локализованными в Х-хромосоме D. melanogaster. Расстояние между генами w и у в процентах кроссинговера составило 1,3, а между генами у и m – 32,6. Если два акта кроссинговера наблюдаются случайно, то ожидаемая частота двойного кроссинговера должна быть равна произведению частот кроссинговера между генами у и w и генами w и m. Другими словами, частота двойных кроссинговеров будет 0,43%. В действительности в опыте был обнаружен лишь один двойной кроссинговер на 2205 мух, т. е. 0,045%. Ученик Моргана Г. Меллер предложил определять интенсивность интерференции количественно, путем деления фактически наблюдаемой частоты двойного кроссинговера на теоретически ожидаемую (при отсутствии интерференции) частоту. Он назвал этот показатель коэффициентом коинциденции, т. е. совпадения. Меллер показал, что в Х-хромосоме дрозофилы интерференция особенно велика на небольших расстояниях; с увеличением интервала между генами интенсивность ее уменьшается и на расстоянии около 40 морганид и более коэффициент коинциденции достигает 1 (максимального своего значения).

Цитологическое доказательство кроссинговера

Прямые цитологические свидетельства обмена частей хромосом во время кроссинговера были получены в начале 30-х годов у дрозофилы и кукурузы.

Рассмотрим опыт Штерна, проведенный на D. melanogaster. Обычно две гомологичные хромосомы морфологически неразличимы. Штерн исследовал Х-хромосомы, которые имели морфологические различия и, следовательно, были гомологичны не полностью. Однако гомология между этими хромосомами сохранялась на большей части их длины, что позволяло им нормально спариваться и сегрегировать в мейозе (то есть нормально распределяться по дочерним клеткам). Одна из Х-хромосом самки в результате транслокации, т. е. перемещения фрагмента Y-хромосомы, приобрела Г-образную форму. Вторая Х-хромосома была короче нормальной, так как часть ее была перенесена на IV хромосому. Были получены самки, гетерозиготные по указанным двум, морфологически различным, Х-хромосомам, а также гетерозиготные по двум генам, локализованным в Х-хромосоме: Bar (В) и carnation (cr). Ген Bar – это полудоминантный ген, влияющий на количество фасеток и, следовательно, форму глаза (мутанты с аллелем В имеют полосковидные глаза). Ген cr контролирует окраску глаз (аллель cr+ обусловливает нормальную окраску глаз, а аллель cr – окраску глаз цвета красной гвоздики). Г-образная Х-хромосома несла аллели дикого типа В+ и cr+, укороченная хромосома – мутантные аллели В и cr. Самки указанного генотипа скрещивались с самцами, имевшими морфологически нормальную Х-хромосому с аллелями cr и В+. В потомстве самок было два класса мух с некроссоверными хромосомами (crB / crB+ и cr+B+ / crB+) и два класса мух, фенотип которых соответствовал кроссоверам (crB+ / crB+ и cr+B / crB+). Цитологическое исследование показало, что у кроссоверных особей произошел обмен участками Х-хромосом, и, соответственно, изменилась их форма. Все четыре класса самок имели по одной нормальной, т. е. палочковидной, хромосоме, полученной от отца. Кроссоверные самки содержали в своем кариотипе преобразованные в результате кроссинговера Х-хромосомы – длинную палочковидную или двуплечую с короткими плечами. Эти опыты, так же как и одновременно полученные аналогичные результаты на кукурузе, подтвердили гипотезу Моргана и его сотрудников о том, что кроссинговер представляет собой обмен участками гомологичных хромосом и что гены действительно локализованы в хромосомах.

Соматический (митотический) кроссинговер.

В соматических клетках иногда происходят обмены между хроматидами гомологичных хромосом, в результате которых наблюдается комбинативная изменчивость, подобная той, которая регулярно генерируется мейозом. Нередко, особенно у дрозофилы и низших эукариот, гомологичные хромосомы синаптируют в митозе. Одна из аутосомно-рецессивных мутаций человека, в гомозиготном состоянии приводящая к тяжелому заболеванию, известному под названием синдром Блюма, сопровождается цитологической картиной, напоминающей синапс гомологов и даже образование хиазм.

Доказательство митотического кроссинговера было получено на дрозофиле при анализе изменчивости признаков, определяемых генами у (yellow – желтое тело) и sn (singed – опаленные щетинки), которые находятся в Х-хромосоме. Самка с генотипом y sn+ / y+sn гетерозиготна по генам у и sn, и поэтому в отсутствие митотического кроссинговера ее фенотип будет нормальным. Однако если кроссинговер произошел на стадии четырех хроматид между хроматидами разных гомологов (но не между сестринскими хроматидами), причем место обмена находится между геном sn и центромерой, то образуются клетки с генотипами y sn+ / y+ sn+ и y+ sn / y+ sn. В этом случае на сером теле мухи с нормальными щетинками появятся близнецовые мозаичные пятна, одно из которых будет желтого цвета с нормальными щетинками, а другое - серого цвета с опаленными щетинками. Для этого необходимо, чтобы после кроссинговера обе хромосомы (бывшие хроматиды каждого из гомологов) y+ sn отошли к одному полюсу клетки, а хромосомы y sn+ – к другому. Потомки дочерних клеток, размножившись на стадии куколки, и приведут к появлению мозаичных пятен. Таким образом, мозаичные пятна образуются тогда, когда рядом расположены две группы (точнее, два клона) клеток, фенотипически отличающиеся друг от друга и от клеток остальных тканей данной особи.

Неравный кроссинговер

Это явление было детально изучено на примере гена Bar (В – полосковидные глаза), локализованного в Х-хромосоме D. melanogaster. Неравный кроссинговер связан с дупликацией какого-либо участка в одном из гомологов и с утратой его в другом гомологе. Обнаружено, что ген В может присутствовать в виде тандемных, т. е. следующих друг за другом, повторов, состоящих из двух и даже трех копий. Цитологический анализ подтвердил предположение о том, что неравный кроссинговер может вести к тандемным дупликациям. В области, соответствующей локализации гена В, на препаратах политенных хромосом отмечено увеличение числа дисков, пропорциональное дозе гена. Предполагается, что в эволюции неравный кроссинговер стимулирует создание тандемных дупликаций различных последовательностей и использование их в качестве сырого генетического материала для формирования новых генов и новых регуляционных систем.

Регуляция кроссинговера

Кроссинговер – это сложный физиолого-биохимический процесс, который находится под генетическим контролем клетки и подвержен влиянию факторов внешней среды. Поэтому в реальном эксперименте о частоте кроссинговера можно говорить, имея в виду все те условия, в которых она была определена. Кроссинговер практически отсутствует между гетероморфными Х- и Y-хромосомами. Если бы он происходил, то хромосомный механизм определения пола постоянно разрушался бы. Блокирование кроссинговера между этими хромосомами связано не только с различием в их величине (оно наблюдается не всегда), но и обусловлено Y-специфичными нуклеотидными последовательностями. Обязательное условие синапса хромосом (или их участков) - гомология нуклеотидных последовательностей.

Для абсолютного большинства высших эукариот характерна примерно одинаковая частота кроссинговера как у гомогаметного, так и гетерогаметного полов. Однако есть виды, у которых Кроссинговер отсутствует у особей гетерогаметного пола, в то время как у особей гомогаметного пола он протекает нормально. Такая ситуация наблюдается у гетерогаметных самцов дрозофилы и самок шелкопряда. Существенно, что частота митотического кроссинговера у этих видов у самцов и самок практически одинакова, что указывает на различные элементы контроля отдельных этапов генетической рекомбинации в половых и соматических клетках. В гетерохроматических районах, в частности прицентромерных, частота кроссинговера снижена, и поэтому истинное расстояние между генами в этих участках может быть изменено.

Обнаружены гены, выполняющие функции запирателей кроссинговера, но есть также гены, повышающие его частоту. Они иногда могут индуцировать заметное число кроссоверов у самцов дрозофилы. В качестве запирателей кроссинговера могут выступать также хромосомные перестройки, в частности инверсии. Они нарушают нормальную конъюгацию хромосом в зиготене.

Обнаружено, что на частоту кроссинговера влияют возраст организма, а также экзогенные факторы: температура, радиация, концентрация солей, химические мутагены, лекарства, гормоны. При большинстве указанных воздействий частота кроссинговера повышается.

В целом кроссинговер представляет собой один из регулярных генетических процессов, контролируемых многими генами как непосредственно, так и через физиологическое состояние мейотических или митотических клеток. Частота различных типов рекомбинаций (мейотический, митотический кроссинговер и сестринские хроматидные обмены) может служить мерой действия мутагенов, канцерогенов, антибиотиков и др.

Биологическое значение кроссинговера

Благодаря сцепленному наследованию удачные сочетания аллелей оказываются относительно устойчивыми. В результате образуются группы генов, каждая из которых представляет собой как единый суперген, контролирующий несколько признаков. В то же время, в ходе кроссинговера возникают рекомбинации – т.е. новые комбинации аллелей. Таким образом, кроссинговер повышает комбинативную изменчивость организмов.

Эволюционное значение сцепленного наследования. В результате сцепления одна хромосома может содержать как благоприятные аллели (например, А), так и нейтральные или относительно неблагоприятные (например, N). Если некоторый гаплотип (например, AN) повышает приспособленность его носителей за счет наличия благоприятных аллелей A, то в популяции будут накапливаться как благоприятные аллели, так и сцепленные с ними нейтральные или относительно неблагоприятные N.

Пример. Гаплотип AN обладает преимуществом перед гаплотипом “дикого типа» (++) за счет наличия благоприятного аллеля А, и тогда аллель N будет накапливаться в популяции, если он селективно нейтральный или даже относительно неблагоприятный (но его отрицательное влияние на приспособленность компенсируется положительным влиянием аллеля А).

Эволюционное значение кроссинговера. В результате кроссинговера неблагоприятные аллели, первоначально сцепленные с благоприятными, могут переходить в другую хромосому. Тогда возникают новые гаплотипы, не содержащие неблагоприятных аллелей, и эти неблагоприятные аллели элиминируются из популяции.

Пример. Гаплотип Al оказывается неблагоприятным по сравнению с гаплотипом «дикого типа» (++) за счет наличия летального аллеля l. Поэтому аллель А (благоприятный, нейтральный ил несколько снижающий приспособленность) не может проявиться в фенотипе, поскольку данный гаплотип (Al) содержит летальный аллель l. В результате кроссинговера возникают рекомбинантные гаплотипы A+ и +l. Гаплотип +l элиминируется из популяции, а гаплотип A+ фиксируется (даже в том случае, если аллель А несколько снижает приспособленность его носителей).

ДОПОЛНЕНИЯ

Принципы генетического картирования

Алфред Стёртевант (сотрудник Моргана) предположил, что частота кроссинговера на участке между генами, локализованными в одной хромосоме, может служить мерой расстояния между генами. Иными словами, частота кроссинговера, выражаемая отношением числа кроссоверных особей к общему числу особей, прямо пропорциональная расстоянию между генами. Тогда можно использовать частоту кроссинговера для того, чтобы определять взаимное расположение генов и расстояние между генами.

Генетическое картирование – это определение положения какого-либо гена по отношению к двум (как минимум) другим генам. Постоянство процента кроссинговера между определенными генами позволяет локализовать их. Единицей расстояния между генами служит 1 % кроссинговера; в честь Моргана эта единица называется морганидой (М).

На первом этапе картирования необходимо определить принадлежность гена к группе сцепления. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты картирования. Все гены разбивают на группы сцепления. Число групп сцепления соответствует гаплоидному набору хромосом. Например, у D. melanogaster 4 группы сцепления, у кукурузы – 10, у мыши – 20, у человека – 23 группы сцепления. Как правило, число генов в группах сцепления зависит от линейных размеров соответствующих хромосом. Так, у плодовой мушки имеется одна (IV) точечная (при анализе в световом микроскопе) хромосома. Соответственно число генов в ней во много раз меньше, чем в остальных, значительно превосходящих ее по длине. Следует также отметить, что в гетерохроматических районах хромосом генов нет или почти нет, поэтому протяженные области конститутивного гетерохроматина могут несколько изменить пропорциональность числа генов и длины хромосомы.

На основании генетического картирования составляются генетические карты. На генетических картах крайнему гену (т.е. наиболее удаленному от центромеры) соответствует нулевая (исходная) точка. Удаленность какого-либо гена от нулевой точки обозначается в морганидах.

Если хромосомы достаточно длинные, то удаление гена от нулевой точки может превышать 50 М – тогда возникает противоречие между отмеченными на карте расстояниями, превышающими 50%, и постулированным выше положением, согласно которому 50 % кроссоверов, полученных в эксперименте, фактически должны означать отсутствие сцепления, т. e. локализацию генов в разных хромосомах. Это противоречие объясняется тем, что при составлении генетических карт суммируются расстояния между двумя наиболее близкими генами, что превышает экспериментально наблюдаемый процент кроссинговера.

Цитогенетическое картирование

Этот метод основан на использовании хромосомных перестроек. В случае гигантских политенных хромосом он позволяет прямо сопоставлять результаты генетического анализа расстояний между изучаемыми локусами и их взаимного расположения с данными о физических размерах определенных хромосомных областей. При облучении и действии других мутагенов в хромосомах часто наблюдаются выпадения (делеции) или вставки небольших фрагментов, сравнимых по величине с одним или несколькими локусами. Например, можно использовать гетерозиготы по хромосомам, одна из которых будет нести группу следующих друг за другом доминантных аллелей, тогда как гомологичная ей – группу рецессивных форм тех же генов. Если хромосома с доминантными генами будет последовательно терять отдельные локусы, то в гетерозиготе будут проявляться рецессивные признаки. Порядок проявления рецессивных признаков указывает на последовательность расположения генов.

При порядке генов AbC в случае делеции, захватывающей ген С, у мух с укороченной хромосомой, потерявшей фрагмент, равный гену С, в фенотипе проявятся аллели с, b и А.

В целом сравнение генетических (кроссинговерных) и цитологических карт показывает их соответствие: чем больший процент кроссинговера разделяет пару генов, тем больше и физическое расстояние между ними. Однако на несоответствие расстояний, определяемых указанными двумя методами, могут влиять два фактора. Во-первых, это области, в которых затруднен или отсутствует кроссинговер (например, в гетерохроматических районах); во-вторых, физическое расстояние будет больше, чем генетическое, если гены разделены зоной «молчащей» ДНК. Расчеты Бриджеса показали, что каждой единице перекреста на карте политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster соответствует 4,2 мкм длины политенных хромосом. Эта длина как минимум равна двум-трем средним генам.

Особенности построения генетических карт у прокариот

Для построения генетических карт у прокариот используется явление конъюгации – переноса генетического материала из одной клетки в другую с помощью специальных кольцевых молекул ДНК (плазмид, в частности, с помощью F–плазмиды).

Вероятность переноса определенного гена в клетку–реципиент зависит от его удаления от F–плазмидной ДНК, а точнее, от точки О, в которой начинается репликация F–плазмидной ДНК. Чем больше время конъюгации, тем выше вероятность переноса данного гена. Это дает возможность составить генетическую карту бактерий в минутах конъюгации. Например, у кишечной палочки ген thr (оперон из трех генов, контролирующих биосинтез треонина) находится в нулевой точке (то есть непосредственно рядом с F–плазмидной ДНК), ген lac переносится через 8 мин, ген recE – через 30 мин, ген argR – через 70 мин и т.д.

Более подробно этот вопрос будет рассмотрен при изучении генетики прокариот.

Картирование хромосом человека

Картирование генов основано на составлении групп сцепления. Чем больше известных мутаций и чем меньше число хромосом, тем легче проводить картирование. В этом отношении человек (помимо того, что у него невозможен классический гибридологический анализ) как объект вдвойне неблагоприятен для картирования: известных генов у него сравнительно немного (по крайней мере, так было до конца 70-х годов), а гаплоидное число хромосом достаточно велико – 22 (не считая половых). Это означает, что вероятность того, что два вновь открытых гена окажутся сцепленными, равна 1/22. По этим причинам анализ родословных, который в какой-то мере заменяет гибридологический анализ, дает довольно ограниченную информацию о характере сцепления.

Более перспективными для картирования генов человека оказались методы генетики соматических клеток. Суть одного из них заключается в следующем. Методы клеточной инженерии позволяют объединять различные типы клеток. Слияние клеток, принадлежащих к разным биологическим видам, называется соматической гибридизацией. Сущность соматической гибридизации заключается в получении синтетических культур путем слияния протопластов различных видов организмов. Для слияния клеток используют различные физико-химические и биологические методы. После слияния протопластов образуются многоядерные гетерокариотические клетки. В дальнейшем при слиянии ядер образуются синкариотические клетки, содержащие в ядрах хромосомные наборы разных организмов. При делении таких клеток in vitro образуются гибридные клеточные культуры. В настоящее время получены и культивируются клеточные гибриды «человек × мышь», «человек × крыса» и многие другие.

В гибридных клетках, полученных из разных штаммов разных видов, один из родительских наборов хромосом, как правило, реплицируется быстрее другого. Поэтому последний постепенно теряет хромосомы. Эти процессы интенсивно протекают, например, в клеточных гибридах между мышью и человеком – видами, различающимися по многим биохимическим маркерам. Если при этом следить за каким-либо биохимическим маркером, например ферментом тимидинкиназой, и одновременно проводить цитогенетический контроль, идентифицируя хромосомы в клонах, образующихся после их частичной утраты, то, в конце концов, можно связать исчезновение хромосомы одновременно с биохимическим признаком. Это означает, что ген, кодирующий этот признак, локализован в данной хромосоме. Так, тимидинкиназный ген у человека находится в хромосоме 17.

Некоторая информация о локализации генов может быть получена при анализе числовых и структурных мутаций хромосом, по встречаемости в семьях хромосом с морфологическими вариациями и по учету наследственных признаков. Для этой же цели используют и частичные моносомии, возникающие в результате делеций. Однако в этих случаях необходимо иметь в виду, что иногда изучаемый ген остается в центрическом фрагменте, но его проявление может быть резко ослаблено в результате эффекта положения или каких-либо иных механизмов регуляции (изменение порядка репликации, отрыв промоторного участка и т. д.). В конце 60-х годов был разработан метод гибридизации in situ, в основе которого лежит специфичность комплементарных взаимодействий гена и его копии (мРНК, а также полученной с помощью обратной транскрипции комплементарной ДНК). Разрешающая способность этого метода гораздо выше на политенных хромосомах, чем на митотических хромосомах человека, однако он постоянно совершенствуется.

Генетическое картирование - это картирование, основанное на методах классической генетики - определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цитогенетическое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. И, наконец, физическое картирование - это обширная группа методов, позволяющая строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.

1)Введение
2) Стратегические подходы к картированию геномов
3) Методы картирования геномов млекопитающих
1.1. Генетическое картирование.
1.3. Физическое картирование.
4)Генетическое картирование генома крупного рогатого скота
5) Словарь
6) Список литературы

Работа содержит 1 файл

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, о локализации и функциях отдельных генов и о структуре генома в целом вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора Мак-Кьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с двухгодичным интервалом между последними шестью публикациями, издание энциклопедий под названием: "Менделевское наследование у человека: каталог генов человека и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in men. Catalog of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes"). Эти издания содержат сводные данные обо всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях. Появление и развитие компьютерных баз данных, возможность совмещения различных типов карт позволило перейти на качественно новый уровень анализа картированных последовательностей.

1.2. Цитогенетическое картирование.

Одновременно, в эти же годы, были достигнуты большие успехи в области цитогенетики, связанные с возможностью дифференциального окрашивания метафазных хромосом. Методы дифференциального окрашивания позволяют идентифицировать на препарате как отдельную хромосому, так и любой участок хромосомы, выявляя так называемые бэнды. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируются около 750 бэндов, на прометафазных хромосомах 2500 - 3000. На сегодняшний день разработаны методы многоцветной окраски - multicolor banding (до 25 цветов) интерфазных и метафазных хромосом.

Рис.3Цитогенетический анализ клона гибридных клеток, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши со спленоцитами, с помощью FISH с меченной биотином пробой специфической к Х -хромосоме. Видно, что в кариотипе гибридов присутствует только одна Х -хромосома. Результаты анализа с помощью ПЦР маркеров показали, что эта X-хромосома происходит из спленоцитов (линия мышей DD) (b). Эти результаты свидетельствуют о том, что в гибридных клетках произошло замещение собственной Х -хромосомы клеток НМ-1 (мыши 129/Ola) на Х -хромосому спленоцитов взрослой самки DD

Цитогенетические карты показывают локализацию маркера с точностью до определенной хромосомы, плеча или хромосомного сегмента. Этот тип карт показывает линейный порядок маркеров в хромосоме. По своей разрешающей способности они занимают промежуточное положение между генетическими картами и собственно физическими картами (ряд авторов относит цитогенетическое картирование к методам физического картирования геномов). Цитогенетические карты основываются на расположении генов без определения их вариабельности, тогда как возможность построения генетических карт зависит от наличия аллельного полиморфизма локусов. Построение цитогенетической карты облегчает развитие других типов физических карт, а именно, дает "скелет", на котором помещаются маркеры или контиги перекрывающихся клонов.

Для построения цитогенетических карт млекопитающих в настоящее время используется ряд методов. Определение хромосомной, а в большинстве случаев и субхромосомной локализации маркеров проводят с использованием гибридов соматических клеток между различными видами млекопитающих или непосредственной гибридизации in situ уникальных молекулярных зондов на митотические хромосомы. К основным методам формирования цитогенетических карт относятся также - хромосомный сортинг (проточная цитометрия), микродиссекции и микроклонирование определенных геномных фрагментов и сравнительное генетическое картирование (сравнительная цитогенетика).

В 90-е годы метод гибридизации получил развитие в модификациях: FISH (гибридизация с использованием флюоресцентной метки) и PRINS (метод, сочетающий гибридизацию на метафазных хромосомах специфических праймеров с последующей ПЦР, включающей меченый биотином нуклеотид в продукт амплификации). Этот подход стал основным методом для построения цитогенетических карт.

Разрешение этого метода составляет от 1 до 3 млн.п.н., поэтому гибридизация является методом картирования с низким уровнем разрешения.

Среди цитогенетических методов большое распространение получил метод картирования геномов млекопитающих с помощью гибридов соматических клеток, с которым связан первый прорыв на пути построения карт генома человека и успехи клеточной биологии. В 70-ым годам была разработана техника экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния культивируемых соматических клеток разных видов, в частности клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Гибридные клетки, значительно превосходящие по своим размерам исходные родительские клетки, оказываются способны не только переживать в условиях культивирования, но и размножаться. Однако размножение этих тетраплоидных гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом, причем в первую очередь элиминируются хромосомы человека.

Так были получены панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение белков человека, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Техника соматической гибридизации явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Таким способом удалось локализовать сотни аутосомных генов.

Соматические гибриды спонтанного происхождения были получены в 1960 году, с тех пор развитие работ по гибридам соматических клеток шло по следующим направлениям: 1) поиск безопасных, удобных и эффективных агентов для слияния клеток; 2) создание селективных систем, позволяющих выделять гибриды соматических клеток; 3) изучение феномена сегрегации хромосом, направления и степени, а также возможности направленной сегрегации в соматических гибридах; 4) использование гибридов соматических клеток для создания хромосомных карт млекопитающих.

Для тонкого картирования разработаны два метода: перенос генов, опосредованный хромосомой (CMGT) и перенос генов в процессе слияния облученной клетки-донора с необлученным реципиентом (IFGT, от англ. irradiation and fusion gene transfer). Первый способ предполагает инкубацию очищенных митотических хромосом с клетками реципиента в присутствии фосфата кальция. При этом происходит встраивание фрагментов донорных хромосом в хромосомы клетки-реципиента. Для идентификации гибридов, содержащих нужные фрагменты ДНК донора, применяют соответствующие методы селекции.

Наиболее широко распространенный пример такого подхода - НАТ-селекция (от англ. hypoxanthine, aminopterin, thymidine) . В присутствии аминоптерина (или сходного с ним метатрексата) ингибируется синтез новых предшественников ДНК. Клетки, лишенные фермента тимидинкиназы (ТК), не могут утилизировать экзогенный тимидин и гибнут в присутствии аминоптерина. Аналогично, клетки, лишенные гипоксантин- фосфорибозилтрансферазы (HPRT), не могут усваивать гипоксантин и также, нежизнеспособны в присутствии аминоптерина.

К сожалению, встроенные фрагменты хромосом зачастую претерпевают реорганизацию, кроме того, есть достоверные данные о предпочтительном проникновении в клетку последовательностей из центромерных областей. Эти недостатки не позволяют использовать CMGT для тотального картирования, хотя данный метод весьма эффективен для обогащения специфическими фрагментами хромосом - составной части стратегии клонирования, называемой "обратной генетикой".

1.3. Физическое картирование.

В отличие от генетических карт, построенных на основе групп сцепления и дающих статистические расстояния между ДНК-маркерами и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния между маркерами в каждой хромосоме.К методам физического картирования относят рестрикционное картирование, RH-картирование, клонирование в YAC (от англ. yeast artificial chromosome), BAC (от англ. bacterial artificial chromosome), космидах, плазмидах и других векторах и контиг-картирование на их основе, а также секвенирование ДНК.

Рис.4 Генетическая карта норки содержит 85 генов, 82 из которых картированы в лаборатории; для 18 генов установлена их региональная локализация, для 8 показан их порядок, а 7 генов были отнесены к группам сцепления хромосом 7 и 12. Рядом с идиограммами хромосом норки приведены данные по ZOO-FISH. Видно, что в геноме норки существуют крупные районы хромосом, гомeологичные хромосомным районам человека

Использование искусственных хромосом создает основу для проведения физического картирования как на хромосомном, так и на субхромосомном уровне.

Основой физического картирования генома является построение физических карт, т.е. определение порядка расположения физических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физических маркеров могут выступать сами гены, анонимные фрагменты ДНК (D-сегменты), точки расщепления ДНК рестриктазами и т. п.

Однако при развитии работ по физическому картированию геномов млекопитающих исследователи столкнулись с трудностями при совмещении данных по картированию. Для преодоления этой проблемы в 1989 г. было предложено стандартизовать все обозначения меченных последовательностей ДНК в геноме, включая все типы картированных последовательностей, будь то просто картированный сегмент ДНК с неизвестной функцией (D-сегменты), последовательность с необычными сайтами рестрикции, проба, выявляющая полиморфизм, последовательность, гибридизующаяся с определенным "бэндом" при гибридизации или STS-маркеры (от англ. "sequenсed tagged site").

Основной особенностью STS-маркеров, а также и основным требованием к ним, является их уникальность в геноме. Эти маркеры облегчают перевод различной информации по картированию на единый "язык" STS для анализа и хранения генетической и молекулярной информации, кроме того, оптимизируется процесс насыщения физической карты генома человека маркерами. Созданные на сегодняшний день электронные молекулярно-генетические базы данных значительно облегчают поиск информации по картированию и секвенированию последовательностей любого изучаемого вида, позволяют оценивать степень гомологии и эволюционной связи между геномами различных видов. В настоящее время одно из основных направлений в данной области - это перевод всех STS-маркеров на основу ПЦР для более удобного использования. К исходному секвенированному участку ДНК подбирается пара праймеров, как правило, с учетом того, чтобы расстояние между ними не превышало 1 т.п.н. для удобства проведения ПЦР. Если участок и праймеры к нему не имеют аналогов в базе данных, содержащих секвенированные на данный момент последовательности ДНК, то праймеры синтезируют и с ними проводят ПЦР, где в качестве матрицы используют тотальную ДНК генома. Если полученный амплификат представляет собой единственный фрагмент на геном, то эта последовательность может считаться уникальной и может быть использована как STS. Вся информация, касающаяся каждого маркера, хранится в базах данных (NCBI, EMBL, DDBJ, GDB и др.). Она включает в себя сведения о нуклеотидной последовательности праймеров, условия реакции ПЦР, длину продукта амплификации и его нуклеотидную последовательность. Одним из результатов международной программы "Геном человека" явилось создание такого количества STS-маркеров, которое позволило покрыть ими весь геном человека через каждые 50 т.п.н. вдоль каждой хромосомы (на сегодняшний день в базах данных зарегистрировано более 60000 STS-маркеров).

Совмещение карт возможно благодаря локализации многих клонированных генетических маркеров на физических картах с помощью гибридизации, то есть привязке к определенным хромосомным сегментам. Эти локусы служат для взаимосвязи генетических карт с физическими и дают возможность выяснения соотношения между генетическими расстояниями в сантиморганах и физическими расстояниями, выраженными в тысячах пар нуклеотидов.

Рис.6 Результаты экспериментов по тестированию плюрипотентности внутривидовых гибридных клеток от слияния эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (линия HM-1 получена от мыши линии 129/Ola, справа) со спленоцитами взрослой самки мыши (линия DD слева). При введении гибридных клеток в полость бластоцисты (реципиентная линия C57BL/J, слева) получено 5 химерных мышей, одна из которых представлена на рисунке в центре. Пятна желтой окраски появились в результате размножения гибридных клеток и их участия в формировании волосяного покрова химеры. Результаты биохимического анализа (маркер Gpi-1, кодирующий глюкозо-6-фосфат изомеразу) химер показали, что гибридные клетки внесли вклад в формирование большинства органов и тканей

4) Генетическое картирование генома крупного рогатого скота (КРС)

Отечественным ученым принадлежит приоритет в картировании генов сельскохозяйственных животных: в 1926 г. А. С. Серебровский и Е. Т. Васина-Попова описали расположение генов в половой хромосоме курицы. Успешно проводившиеся А. С. Серебровским исследования по генетическому картированию были прерваны и до сих пор в нашей стране на материале сельскохозяйственных животных не возобновлены. В то же время за рубежом интерес к построению генетических карт лабораторных и домашних животных все более возрастает. Иллюстрацией сказанного может служить то, что на исследования генома собаки с целью построения генетической карты этого вида в США ассигновано на 5 лет 750тыс. долларов. Целью этого проекта является нанесение на генетическую карту до 400 маркеров, что позволит в частности, определить локализацию генов тех или иных наследственных болезней.

Естественно, что особое внимание уделяется картированию геномов важнейших видов сельскохозяйственных животных. Созданный в 1990 г. проект их генетическое картирование должен был получить в 1991 г. финансирование в размере 10 мил. долларов в год. Первый объект планируемых исследований – крупный рогатый скот, в дальнейшем предполагается изучить геном овец, коз, свиней, лошадей, кур. В настоящем обзоре мы рассмотрим современное состояние исследований, посвященных построению генетических карт генома крупного рогатого скота (КРС) – биологического вида Bos taurus.

При картировании генов крупного рогатого скота исследуются три метода. Первый из них – популяционно- генеалогический анализ. Именно с помощью этого метода был обнаружен первый случай сцепления генов у крупного рогатого скота (тесное сцепление генов казеинов молока). КРС относится к числу малоплодных и медленно размножающихся животных, поэтому стандартный генетический анализ в этой же ферме, в которой он используется для картирования геномов лабораторных животных, в данном случае невозможен. Применяемый подход заимствован из арсенала генетики человека и состоит и состоит в определении достоверности отклонения наблюдаемой частоты рекомбинации между двумя генами от 0,5 т. е. определяется наличие сцепления. Соответствующий статистический тест носит название lod-score-test. При использовании этого теста для каждой семьи, в которой обнаружено расщепление по анализируемым генам вычисляется величина z:

1.1. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.

1.1.1. Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация

Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зон­ды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательно­стями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактив­ными изотопами или флуоресцентными краси­телями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные ис­комому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, стро­го соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точ­ностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.

1.1.2. Хромосомный пейнтинг

Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК. Информация об интенсивно­сти свечения каждого флуорохрома записывается на компьютере отдельно и каждому из таких изображений присваивается свой собственный псевдо­цвет.

1.1.3. Гибридизация соматических клеток

При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматиче­ские гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, че­ловек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши. Оказалось, что многие гены в геноме мыши гомологичны по структуре ге­нам человека.

1.2. Генетическое картирование

Генетические карты - это карты-схемы взаимного расположения генов на индивидуальных хромосомах, т.е. находящихся в одной группе сцепления.

Принципы генетического картирования были впервые разработаны Т. Морганом. Им же была составлена первая генетическая карта X-хромосомы дрозофилы, основанная на учете частоты образования кроссоверных и некроссоверных гамет у самок, гетерозиготных по рецессивным мутациям, локализованным в Х-хромосоме. Так. в мейозе гетерозиготных самок кроссинговер между генами у (желтое тело) и w- (белые глаза) про­исходил в 1,5% случаев, между генами w и m (миниатюрные крылья) -34,5%, а между генами у и т - 36% случаев.

Генетические карты сцепления правильно отражают порядок распо­ложения генов (или генетических маркеров) на хромосомах, однако рас­стояния между ними имеют относительные значения, т.е. не соответствуют реальным физическим расстояниям.

1.3 . Молекулярные маркеры ДНК и их использование для генетического картирования

1.3.1. ПДРФ - маркеры ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК,

Было установлено, что генетическим маркером может быть любое место в геноме, где произошло изменение в последовательности ДНК, которое обнаруживается как внут­реннее различие между индивидами в популяции, но никаких внешних (фенотипических; различий между ними при этом не наблюдается.

У бактерий установлен и выделен целый ряд ферментов рестриктаз, которые узнают специфические последовательности в молекуле ДНК (обычно составляющие 4-6 нуклеотидов) и разрезают двойную спираль внутри или вблизи сайта узнавания, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты, или рестрикты.

Отсутствие сайта узнавания может быть связано с делецией. инсер-цией или заменой нуклеотидов. Следовательно, любая мутация, изменяю­щая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.

1.3.2. Молекулярные маркеры, основанные на полимера гной цепной реакции (ПЦР-маркеры)

Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует при­родный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, проис­ходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с уча­стием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваива­ется вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (вос­произведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.

1.3.3. Микросателлиты и минисателлиты как молекулярные маркеры

Разновидностями сатДНК являются.микросателлиты (МКС, или про­стые повторяющиеся последовательности - ППП) и минисателлиты (МНС). Минимальная повторяющаяся единица (КОР) микросателлитов включает от 1 до 10 пар нуклеотидов, минисателлитов - 15 -70 пн. Их рас­положение в геноме и число повторений коровых единиц специфичны для каждого организма.

1.4. Физическое картирование

Физическое картиро­вание основано на прямом анализе молекул ДНК. составляющих каждую хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель -определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме

1.4.1. Создание рестрикционных карт

Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции пред­ставляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и мо­жет использоваться для его идентификации.

Банк генов. Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага К и бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага А., который обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК, включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бакте­риофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосо­мы дрожжей YAK - (ЯК) и бактерий ВАС - (БАК) хромосомы.

1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура "Прогулка по хромосоме"

Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонирован­ных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибриди­зации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последователь­ность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библио­тек клонов.

"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упоря­дочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, по­лученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя раз­ными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиоте­ке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-маркирующий сайт - STS), он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.

Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.

1.4. Определение нуклеотидной последовательности генома (секвенирование ) Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого друго­го организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом.

1.5. Кандидатное картирование

В рамках этих подходов картировать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции).